Durch das Schmelzen der DNA können Krankheitserreger schneller und genauer nachgewiesen werden

Eine neue Analysemethode kann Krankheitserreger in Blutproben schneller und genauer nachweisen als Blutkulturen, die derzeit Stand der Technik zur Infektionsdiagnostik sind. Die neue Methode, digitale DNA-Schmelzanalyse genannt, kann in weniger als sechs Stunden Ergebnisse liefern, während die Kultur je nach Erreger typischerweise 15 Stunden bis mehrere Tage benötigt.

Diese Methode ist nicht nur schneller als Blutkulturen, sondern führt im Vergleich zu anderen aufkommenden DNA-Erkennungstechnologien wie Next Generation Sequencing auch deutlich seltener zu falsch positiven Ergebnissen.

Warum spielt es eine Rolle?

Es ist eine Erfahrung, die die meisten Eltern gemacht haben: Sie gehen mit Ihrem Kind zum Arzt, weil es Fieber hat, vielleicht hustet oder niest. Ihr Kind hat eine Infektion, sagt der Arzt, aber es ist unklar, ob es sich um eine bakterielle oder virale Infektion handelt. Manchmal verschreibt der Arzt „nur für den Fall“ Antibiotika.

Manchmal wird eine Blutabnahme angeordnet, um festzustellen, ob Bakterien vorhanden sind. Manchmal fällt das Ergebnis zwei bis drei Tage später wieder negativ aus. Dann werden Sie gebeten, Ihrem Kind weiterhin Antibiotika zu verabreichen, damit es nicht anfängt, antibiotikaresistente Bakterien in seinem Körper zu kultivieren.

Das gleiche Szenario spielt sich auf pädiatrischen Intensivstationen und Notaufnahmen ab, wobei die Risiken höher sind, wenn ein Kind Symptome einer Sepsis aufweist. In diesem Fall erhalten bis zu 30 % der Patienten eine falsche Behandlung, was ihr Sterberisiko tatsächlich erhöht. Bei einer Sepsis kommt es noch mehr auf Schnelligkeit an, da das Sterblichkeitsrisiko mit jeder Stunde, in der die Infektion nicht diagnostiziert oder falsch behandelt wird, um 4 % steigt.

Die Forscher führten eine klinische Pilotstudie mit Blutproben von pädiatrischen Patienten durch und zeigten, dass die Ergebnisse ihrer Methode genau mit den Ergebnissen der Blutkultur bei der Erkennung von Sepsis übereinstimmten. Aber ihre Methode entdeckte Krankheitserreger 7,5 Stunden bis etwa 3 Tage schneller als die klinische Blutkultur. Die Tests gehen auch über ein einfaches positives oder negatives Ergebnis hinaus, um zu quantifizieren, wie viel des Erregers in Proben vorhanden ist.

Die Methode basiert auf dem universellen digitalen hochauflösenden DNA-Schmelzverfahren, bei dem die DNA erhitzt wird, bis sie auseinanderfällt. Jede DNA-Sequenz erhält beim Schmelzen eine spezifische Signatur. Während der Schmelzprozess abgebildet und analysiert wird, bestimmen maschinelle Lernalgorithmen, welche Arten von DNA in den Proben vorhanden sind, und identifizieren Krankheitserreger.

Das Forschungsteam präsentiert seine Ergebnisse in Das Journal of Molecular Diagnostics.

„Dies ist das erste Mal, dass diese Methode an Vollblut von Patienten getestet wurde, bei denen der Verdacht auf Sepsis besteht. Daher ist diese Studie eine realistischere Vorschau darauf, wie die Technologie in realen klinischen Szenarien funktionieren könnte“, sagte Stephanie Fraley, die leitende Autorin des Papiers Professor am Shu Chien-Gene Lay Department of Bioengineering an der University of California San Diego.

Schätzungsweise jeder fünfte Todesfall weltweit ist auf sepsisbedingte Komplikationen zurückzuführen. Und 41 % dieser Todesfälle ereignen sich bei Kindern. Die Früherkennung ist entscheidend für das Überleben einer Sepsis, da das Sterblichkeitsrisiko mit jeder Stunde, in der die Infektion nicht diagnostiziert oder falsch behandelt wird, um 4 % steigt.

Typischerweise verabreichen Ärzte Sepsispatienten Antibiotika, während sie auf die Ergebnisse der Blutkulturen warten. Dies kann auf der ganzen Linie zu einer Antibiotikaresistenz führen.

„Die Quintessenz ist, dass wir nicht auf der Grundlage von Beweisen behandeln“, sagte Fraley. „Und je mehr wir ohne Beweise behandeln, desto mehr können wir unbeabsichtigte Probleme verursachen. Manchmal behandeln wir Patienten mit Pilz- oder Virusinfektionen mit Antibiotika. Dies kann zu Antibiotikaresistenzen führen und das Mikrobiom des Patienten erheblich verändern.“

Wie die Methode funktioniert

Alles begann mit einem Milliliter Blut aus jeder Probe von 17 Patienten in der klinischen Pilotstudie. Die Proben wurden gleichzeitig mit Proben für Blutkulturen von Säuglingen und Kleinkindern entnommen.

Die Forscher perfektionierten die Methoden der DNA-Isolierung und des maschinellen Lernens, um Signale von menschlicher DNA im Vergleich zur Pathogen-DNA in den Proben zu reduzieren oder zu eliminieren. „Da die menschliche DNA die DNA von Krankheitserregern deutlich übersteigt, können wir die ‚Nadel im Heuhaufen‘, die den Krankheitserreger darstellt, besser erkennen“, sagte Fraley.

Mridu Sinha, einer von Fraleys ehemaligen Ph.D. Studenten und jetzt CEO von Melio, dem von ihnen mitbegründeten Startup-Unternehmen, optimierten einen Algorithmus für maschinelles Lernen, um den Unterschied zwischen Schmelzkurven von Krankheitserregern und Hintergrundgeräuschen zuverlässig zu erkennen. Der Algorithmus gleicht die Kurven mit einer Datenbank bekannter DNA-Schmelzkurven ab. Es ist auch in der Lage, Kurven zu erkennen, die von Organismen erstellt wurden, die nicht in dieser Datenbank enthalten sind, die in einer Probe auftauchen könnten, wenn sie seltene oder neu auftretende Krankheitserreger enthält.

Die Ergebnisse stimmten nicht nur genau mit den Ergebnissen von Blutkulturen aus denselben Blutproben überein; Sie lieferten auch keine falsch positiven Ergebnisse. Im Gegensatz dazu verstärken andere Arten von Tests, die auf Nukleinsäureamplifikation und DNA-Sequenzierungsdatenbanken der nächsten Generation basieren, jegliche vorhandene DNA, was zu falsch positiven Ergebnissen führt. DNA gelangt häufig aus der Umgebung, aus Reagenzgläsern, Reagenzien, der Haut usw. in die Probe. Eine Probenkontamination kann zu Problemen bei der Interpretation der Testergebnisse führen.

„Unser Test umfasst Probenvorbereitungsprozesse, Assay-Designtechniken und Algorithmen, die sicherstellen, dass wir nur DNA von intakten Organismen nachweisen, was klinisch relevant ist“, sagte Sinha.

Zu den nächsten Schritten gehören die Durchführung einer umfassenderen klinischen Studie sowie die Ausweitung der Methode auf erwachsene Patienten.

Fraley und Sinha lizenzierten die Technologie von der UC San Diego und gründeten das Start-up Melio, um ihre Methode zu kommerzialisieren.

„Wir möchten Ärzten die Möglichkeit geben, ihre Patienten nicht auf der Grundlage aggregierter Daten, sondern mit präzisen, genauen individuellen Daten zu behandeln und so eine wirklich personalisierte Medizin zu ermöglichen“, sagte Fraley.

Was schmilzt DNA?

Die DNA in den Blutproben wird erhitzt und schmilzt bei Temperaturen zwischen 50 und 90 Grad Celsius – etwa 120 und 190 Grad Fahrenheit.

Wenn die DNA-Doppelhelix schmilzt, brechen die Bindungen, die die DNA-Stränge zusammenhalten. Abhängig von der DNA-Sequenz sind die Bindungen unterschiedlich stark und das verändert die Art und Weise, wie sich die Stränge voneinander lösen. Dadurch entsteht ein einzigartiger sequenzabhängiger Fingerabdruck, den Forscher mithilfe eines speziellen Farbstoffs erkennen können. Der Farbstoff bewirkt, dass beim Abwickelvorgang fluoreszierendes Licht abgegeben wird, wodurch eine sogenannte Schmelzkurve entsteht – eine einzigartige Signatur für jeden Krankheitserregertyp.

In der Vergangenheit wurden durch das Schmelzen von DNA einfache Kurven erzeugt, die hauptsächlich dazu dienten, zu bestätigen, dass eine PCR-Reaktion funktionierte. Mit diesem neuen Ansatz wird das Schmelzen jedoch weiterentwickelt, um komplexe Schmelzkurvensignaturen zu erzeugen, die nur für Gensequenzen gelten.