Studie zur Arzneimittelumnutzung zeigt, dass Lonafarnib gegen RSV wirksam ist

In einer in der Zeitschrift veröffentlichten Studie Naturkommunikation, untersuchten Forscher ReFRAME (kurz für Repurpose, Focused Rescue und Accelerated Medchem), eine Bibliothek zur Medikamentenwiederverwendung, nach Medikamenten gegen das Respiratory Syncytial Virus (RSV). Sie identifizierten Lonafarnib als wirksamen Inhibitor des RSV-Fusionsproteins und untersuchten dessen therapeutisches Potenzial gegen eine RSV-Infektion.

Studie: Screening zur Wiederverwendung von Arzneimitteln identifiziert Lonafarnib als Inhibitor des Respiratory-Syncytial-Virus-Fusionsproteins. Bildnachweis: Joshimerbin / Shutterstock

Hintergrund

RSV verursacht schwere Infektionen der unteren Atemwege bei kleinen Kindern, immunsupprimierten Personen und älteren Erwachsenen und führt zu Millionen von Krankenhauseinweisungen und Todesfällen pro Jahr. Die jüngste Pandemie der Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19) und die damit verbundenen Eingriffe haben zu einer veränderten RSV-Epidemiologie mit einer vorübergehenden Unterdrückung und Wiederbelebung der RSV-Zirkulation geführt, was Bedenken hinsichtlich einer Zunahme von Infektionen aufkommen lässt.

Die Behandlung einer RSV-Infektion verläuft derzeit symptomatisch. Während Ribavirin zeigt in vitro Wirksamkeit, es ist bei Patienten nicht sehr wirksam. Palivizumab bietet Prophylaxe, ist jedoch kostspielig, führt nur zu einer teilweisen Reduzierung der Krankenhauseinweisungsraten und steht vor Herausforderungen wie einer schnellen Resistenzentwicklung. Obwohl Nirsevimab kürzlich zur RSV-Prävention bei Neugeborenen zugelassen wurde, mangelt es weiterhin an therapeutischen Optionen.

Verschiedene antivirale Strategien gegen RSV, einschließlich Immunglobulinen, werden entwickelt. Umgewidmete Bibliotheken mit zugelassenen Arzneimitteln oder Verbindungen in der klinischen Entwicklung dienen als Repositorien mit Potenzial für beschleunigte therapeutische Anwendungen. Die Forscher der vorliegenden Studie durchsuchten die ReFRAME-Bibliothek und identifizierten Lonafarnib als RSV-Fusionsprotein-Inhibitor und demonstrierten gleichzeitig seine therapeutischen Fähigkeiten.

Über die Studie

Die Bibliothek (aus 12.000 Molekülen) wurde mit einem rekombinanten RSV-Subtyp-A-Stamm-GFP-Reportervirus (kurz für grün fluoreszierendes Protein) gescreent. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde mithilfe eines MTT (kurz für 3-) bestimmt.[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-Diphenyltetrazoliumbromid)-Assay. Die primären Trefferkriterien waren eine RSV-Infektion ≤ 16 % und eine Zelllebensfähigkeit ≥ 80 %. Vierzehn Moleküle erfüllten die Hauptkriterien und 16 weitere Moleküle wurden ausgewählt. Zwei Farnesyl-S-Transferase-Inhibitoren, Lonafarnib und Tipifarnib, wurden hinsichtlich ihrer hemmenden Wirkung auf die RSV-Infektion untersucht und verglichen. Um das potenzielle virale Ziel von Lonafarnib zu identifizieren, wurden Passagen des RSV-Reportervirus mit steigenden Lonafarnib-Dosen durchgeführt. Die resultierenden Viruspopulationen wurden sequenziert und Mutationen analysiert. Die Studie umfasste außerdem orthogonale Infektionstests, Plaque-Reduktionstests, RSV-Lentiviral-Pseudotyp-Tests und RSV-F-Protein-Zell-zu-Zell-Membranfusionstests. Oberflächenplasmonresonanz- und Kristallisationsexperimente wurden durchgeführt, um die Wechselwirkung von Lonafarnib mit einem rekombinanten RSV-Subtyp-A-Präfusions-F-Protein zu untersuchen.

Die therapeutischen Wirkungen von Lonafarnib wurden durch Inokulation von A549-Zellen mit HRSV-A-GFP, Behandlung mit Lonafarnib oder Ribavirin 24 Stunden nach der Inokulation und Überwachung der Virusausbreitung über die Zeit bewertet. Die Wirkung des Medikaments in einem natürlicheren Modell der RSV-Infektion und des Zelleintritts wurde anhand der immortalisierten menschlichen Basalzelllinie BCi-NS1.1 untersucht, die weiter in das pseudostratifizierte Flimmerepithel differenziert wurde.

Sechs Mäuse wurden mit oralem Lonafarnib oder einer Lösungsmittelkontrolle behandelt und mit einem RSV-Reportervirus infiziert. Das Gewicht der Tiere wurde überwacht und am 4. Tag wurden Gewebe entnommen und die RSV-Kopienzahl der Lunge gemessen.

A Screening- und Validierungsverfahren. B HEp-2-Zellen wurden mit rHRSV-A-GFP in Gegenwart von 5 µM Verbindung infiziert. 48 Stunden später wurden Infektion und Lebensfähigkeit der Zellen mittels GFP- und MTT-Messungen quantifiziert. Gepunktete Linien geben die primären Trefferkriterien an und Punkte stellen Mittelwerte für zwei technische Replikate dar. C HEp-2-Zellen wurden mit HRSV-A-Luc bei einer MOI von 0,01 infiziert und mit den angegebenen Verbindungskonzentrationen behandelt. 24 Stunden später wurde der Überstand für eine zweite Infektionsrunde auf neue Zellen übertragen. Die Lumineszenz wurde 24 Stunden nach der Inokulation beider Infektionsrunden quantifiziert. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde mittels MTT-Auslesung in behandelten, aber nicht infizierten Zellen gemessen. Mittelwert ± SD von drei unabhängigen Experimenten. Bekannte RSV-Inhibitoren (F-Protein: Presatovir; N-Protein: RSV604, IMPDH-Inhibitoren (AVN944, Mycophenolsäure), HSP90-Inhibitoren (Radiciol, HSP990). 4-Sulfocalix[6]Arenhydrat (4SC6AH, unbekanntes Ziel). Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Resultate und Diskussion

Einundzwanzig Moleküle, darunter Lonafarnib, zeigten eine antivirale Aktivität gegen RSV. Lonafarnib ist für die Behandlung des Hutchinson-Gilford-Progerie-Syndroms zugelassen und befindet sich in klinischen Phase-III-Studien für Hepatitis-Delta-Virus-Infektionen. Lonafarnib, jedoch nicht Tipifarnib, zeigte eine Hemmung der RSV-Infektion, was durch eine verringerte Reportervirusaktivität, eine Plaquereduktion und eine unterdrückte Synzytienbildung in infizierten Zellen belegt wurde. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass Lonafarnib und nicht Tipifarnib mit dem Präfusions-F-Protein an einer Bindungsstelle interagiert, die zuvor für andere Fusionsinhibitoren beobachtet wurde.

Lonafarnib-exponierte Viruspopulationen häuften zwei kodierende Mutationen (T335I und T400A) innerhalb des RSV-Fusionsproteins an, was zu einer phänotypischen Resistenz gegen Lonafarnib führte. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass Lonafarnib den Eintritt von RSV in die Zellen hemmt, indem es an das Fusionsprotein bindet und die Membranfusion hemmt. Diese Hemmung konnte durch Resistenzmutationen im Fusionsprotein überwunden werden.

In vitroKombinationen von Lonafarnib und Ribavirin zeigten bei ausgewählten Dosierungen eine geringe hemmende oder leicht synergistische Wirkung. Die Behandlung mit Lonafarnib nach der Inokulation in A549-Zellen schränkte die Ausbreitung des HRSV-GFP-Virus im Vergleich zu den Kontrollen um 30 % ein. Im BCi-NS1.1-Zellkulturmodell hemmte die prophylaktische Lonafarnib-Behandlung sowohl von der apikalen als auch von der basolateralen Seite dosisabhängig die RSV-Infektion, was zu einer 10- bis 15-fachen Reduzierung der Viruslast führte. Auch die therapeutische Anwendung von Lonafarnib nur von der basolateralen Seite reduzierte die Viruslast bei einer klinischen RSV-Isolatinfektion um etwa 50 %.

In vivo, zeigten mit Lonafarnib behandelte Tiere im Vergleich zu Kontrollen ein deutlich verringertes Reportervirus-Signal in Lunge und Nase. Am 4. Tag wurde ein dosisabhängiger Rückgang der viralen Ribonukleinsäure in der Lunge der behandelten Mäuse beobachtet und es kam zu einem geringeren Gewichtsverlust im Vergleich zu den Kontrollen. Allerdings wurden zelluläre Infiltrate in der Lunge von mit Lonafarnib behandelten Mäusen beobachtet.

Abschluss

Zusammenfassend identifizierte die Studie Lonafarnib als potenziellen therapeutischen Kandidaten für die RSV-Behandlung und unterstreicht den Nutzen von Studien zur Arzneimittelumwidmung. Die Ergebnisse belegen die vielversprechende antivirale Aktivität von Lonafarnib in Zellkulturen sowie in Mausmodellen einer RSV-Infektion. Weitere Untersuchungen sind erforderlich, um die Ergebnisse zu bestätigen.